wb电转液有沉淀

wb电转液有沉淀是因蛋白没有变性完全，可以适当提高SDS浓度，同时将样品煮沸时间延长；也不排除抗原浓度过高，这时再加入适量上样缓冲液即可。蛋白质印迹法（免疫印迹试验），即Western Blot。它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。

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wb一抗为什么会有沉淀

wb一抗会有沉淀是因为你的蛋白没有变性完全。反复用的抗体用久了会产生沉淀，毕竟抗体也是蛋白。至于对于实验的影响，一般有沉淀了就不建议继续用了。

做western蛋白煮沸后有沉淀怎么办

western

blot样品煮蛋白后结块是经常会有现象

如果是

SDS-PAGE

，加了上样

缓冲液

后依然煮蛋白后结块，那说明蛋白样品浓度过高，已经超出了SDS可以结合的浓度。建议降低样品的浓度即可

如果没有加含有SDS的上样缓冲液，那么就是蛋白样品被煮沸后变性沉淀了。加入溶解剂即可

wb电泳上样量大后胶上有蓝色

wb电泳上样量大后胶上有蓝色原因是部分样品未完全溶解有沉淀。沉淀也被溴酚蓝染色，故电泳时加样孔里会有残留的蓝色。这对做western并没有影响，可以直接把浓缩胶部分切掉只做分离胶部分的转膜，那么残留的蓝色就不会影响到转膜的效果。

wb转膜液絮状物

正常的。wb转膜液絮状物是正常的。转膜时转膜液要浸没凝胶和膜,否则也可能出现上述情况。

提纯的蛋白出现沉淀影响做western blot吗

不影响，因为蛋白沉淀可能是因为蛋白浓度过高，导致蛋白聚集，变性，或结构改变引起沉淀，而做WB前要加SDS上样缓冲液，并煮沸，目标是为了让蛋白彻底变性，SDS作为一种去污剂，也可以增加蛋白的溶解度，最后离心，会取溶解的部分去上样的。

而且如果加入loading以后，可能会发现，沉淀反而变少了，就是因为一部分沉淀的蛋白被溶解了。

Western blot 实验技术及常见问题分析？

Western blot基本原理：

在电场的作用下将电泳分离的多肽从SDS-PAGE凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。

Western blot应用：

目的蛋白的表达特性分析；

目的蛋白与其他蛋白的互作；

目的蛋白的组织定位；

目的蛋白的表达量分析；

Western blot一般流程：

蛋白样品的制备：

1.水溶液提取法：稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解 度大，是提取蛋白质最常用的的溶剂，操作相对麻烦，重复性一般；

2 有机溶剂提取法；

3 离心管柱提取法：超快速，易用，高产及重复性强；

4 通过层析或电洗脱法制备目的蛋白。

Western blot注意事项和常见问题：

1 我的细胞提取液有的有沉淀，有的很清亮，为什么呢？

答：有沉淀可能因为你的蛋白没有变性完全，可以适当提高SDS 浓度，同时将样品煮沸时间延长； 也不排除你的抗原浓度过高，这时再加入适量上样缓冲液即可。

2 我做的蛋白质分子量很小（10 KD），请问怎么做WB？

答：可以选择0.2 μm的膜，同时缩短转移时间。也可以将两张膜叠在一起，再转移。

3最后显色时用 DAB好还是ECM好？

答：DAB 有毒，但是比较灵敏，是HRP 最敏感的底物；ECM结果容易控制，但被催化时灵敏度差一点，但如果达到阀值，就特别灵敏，可以检测pg 级蛋白，具体可以根据你实验的情况。

4 要验证某个细胞上有无该蛋白的存在，需要做免疫组化和western blot试验吗？做这两个试验时的一抗和二抗可以共用吗？

答：①免疫组化可以用来进行定位，但是不能精确定量，而且有时会有假阳性，不易与背景区分；Western

blot可以特异性检测某个蛋白质分子，进行定 量，但是不能定位。

②两种实验的一抗有时候不能通用，公司的产品说明一般都会说明可以进行什么实验，在免疫组化时，是否适合石蜡切片或者冰冻切片。

5 细胞水平要做western blot，多少细胞提的蛋白够做western blot？

答：一般5×106就足够了。

6 同一样品能同时提RNA又提蛋白么？这样对western blot有无影响？

答：能，没有问题。

7同一蛋白样品能同时进行两种因子的Western Blot检测吗？

答：当然可以，有的甚至可以同时测几十种样品。

8 蛋白变性后可以存放多久？

答：－80℃，一两年没有问题。最关键两条：不要被蛋白酶水解掉；不要被细菌消化掉（也是被酶水解了）。

9 二抗是生物素化的抗体，三抗是亲和素生物素体系，不知采用这样的方案后，封闭液是否要作调整，能否再用5％的脱脂奶粉呢？

答：不能使用脱脂奶粉，因为脱脂奶粉中含生物素，用BSA代替应该好一点。

10 做组织样品的western的时候，怎样处理样品？

答：必须进行研磨、匀浆、超声处理，蛋白质溶解度会更好，离心要充分，膜蛋白需用更剧烈的方法抽提，低丰度膜蛋白可能还要分步抽提(超速离心)。还有一点就是组织中的蛋白酶活性更强，需要注意抑制蛋白酶的活性。

11 免疫组化和Western Blot可以用同一种抗体吗？

答：免疫组化时抗体识别的是未经变性处理的抗原决定簇（又称表位），有些表位是线性的，而有的属于构象型；线性表位不受蛋白变性的影响，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；构象型表位由于受蛋白空间结构，煮后变性会消失。如果你所用的抗体识别的是蛋白上连续的几个氨基酸，也就是线性表位，那么这种抗体可同时用于免疫组化和Western，而如果抗体识别构象形表位，则只能用于免疫组化。

12 在做Western Blot时，PVDF膜用甲醇浸泡的目的？

答：PVDF膜用甲醇泡的目的是为了活化PVDF膜上面的正电基团，使它更容易跟带负电的蛋白质结合，做小分子的蛋白转移时多加甲醇也是这个目的。

13 检测同一抗体的磷酸化和非磷酸化的抗原可以在同一张膜上吗？

答：可以。

14 蛋白质的分子量跨度很大，如要分离小21KD，中至66KD，大至170KD，可以一次做好吗？

答：这么广的分布不好转移，一般建议：21kd和66kd可以一起转，12％SDS-PAGE，湿转120mA， 45-60min就可以了， 可以根据你实验室的经验调节；170kd 用 7% SDS－PAGE，200mA 90-120min。

15 细胞裂解液选择蛋白酶抑制剂时有什么原则吗？受不受组织来源的影响？胞膜和胞浆有区别吗？

答：一般来说提取时加入广谱的蛋白酶抑制剂就可以了，操作时保持低温。若有特殊要求可以选择相应的蛋白酶抑制剂。

16 PVDF膜和膜结合蛋白的原理是什么？

答：一般而言，纤维素膜是通过疏水作用来和蛋白质相联，这样的话，反复洗几次后，蛋白容易掉下来，结果较差。PVDF膜主要通过它膜上的正电荷和蛋白接合，同时也有疏水作用，但相对较弱。这样的话，PVDF膜和蛋白接合较牢，不易脱落，结果较好。

17 westernblot内参选择什么合适？

答：这与目标抗原的表达位置有关，对于胞浆和全细胞蛋白，可选择内参β-actin、GAPDH和Tubulin；线粒体蛋白则可选择内参VCDA1/Porin和COXIV；核内抗原可以选择内参Lamin B1、TBP和histone。

18不能很好地将大分子量蛋白转移到膜上，转移效率低？

答：转移缓冲液中加入20% 甲醇（终浓度），因为甲醇可降低蛋白质洗脱效率，但可增加蛋白质和NC膜的结合能力，甲醇可以防止凝胶变形，甲醇对高分子量蛋白质可延长转移时间；转移缓冲液加入终浓度0.1%SDS，也能增加转移效率；使用戊二醛交联；降低凝胶浓度，如低至6-7%或提高转膜电压/电流，增加转移时间。

19转膜时凝胶肿胀或卷曲？

答：可将凝胶在转膜前放到转膜缓冲液中浸泡5-10min。

20跑胶的条带歪斜或者漂移？

答：电转仪长期使用导致海绵变薄，“三明治”结构不紧凑导致，可更换或者在两块海绵之间垫上少许普通的草纸。

21转膜后膜上有单个或多个白点？

答：转膜时确保膜和胶块之间没有气泡。

22转膜缓冲液过热？

答：缓冲液中离子浓度太低，电流或者电压过高，转膜过程中注意降温。

23显影后胶片背景太高？

答：转膜前PVDF膜没有用100%甲醇完全浸湿；洗膜不充分，可以增加膜洗涤次数；封闭不完全，选择合适的封闭液和提高封闭时间；二抗浓度过高，降低二抗浓度；一抗特异性不强，换用特异性较强的单克隆抗体；曝光时间过长，减少曝光时间。

24结果没有条带或者条带很浅，杂交信号很弱？

答：样品中不含靶蛋白或者含量太低，可增加蛋白上样量，设置已知标准量蛋白的对照；抗体稀释比例太低，孵育时间不够；转膜不好，转膜后可先用丽春红染色观看染色效果；曝光时间过短，增加曝光时间；抗体保存不当，效价降低。

25目的条带位置偏低或者偏高？

答：胶浓度不适合，高分子量要用低浓度胶，小分子蛋白要用高浓度胶。

26有非特异性条带？

答：目的蛋白有多个修饰位点（磷酸化位点、糖基化位点、乙酰化位点等），本身可以呈现多条带；一抗特异性不好，换用特异性较好的单克隆抗体；二抗非特异性引起的结果，可设立一组不加一抗只加二抗的平行对照来检测二抗是否有非特异性结合；样品蛋白质可能降解，提取蛋白时注意冰上操作，加入适当的蛋白酶抑制剂，避免样品反复冻融；抗体浓度过高，降低一抗和二抗的浓度。

27胶片是一片空白，是怎么回事？

答：如果能够排除下面的几个问题那么问题多半出现在一抗和抗原制备上。 二抗的HRP 活性太强，将底物消耗光；ECM底物中H2O2，不稳定，失活；ECL底物没覆盖到相应位置；二抗失活。

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目的条带是白色，周围有背景？

答：目的蛋白含量太高；一抗浓度偏高，二抗上HRP催化活力太强。

WB实验问题总结（Western blot蛋白质印迹）

答：原因有很多：

a) 你的细胞中不表达这种蛋白质，换一种细胞；

b) 你的细胞中的蛋白质被降解掉了，你必需加入PMSF，抑制蛋白酶活性；

c) 你的抗体不能识别目标蛋白，多看看说明，看是否有问题。

答：a) 有沉淀可能因为你的蛋白没有变性完全，可以适当提高SDS 浓度，同时将样品煮沸时间延长；

b) 也不排除你的抗原浓度过高，这时再加入适量上样缓冲液即可。

答：可以选择0.2μml的膜，同时缩短转移时间。也可以将两张膜叠在一起，再转移。其他按步骤即可。

答：可以加大抗原上样量。这是最主要的。同时也可以将一抗稀释比例降低。

答：减少抗原上样量，降低一抗浓度，改变一抗孵育时间，提高牛奶浓度。 

答：你的一抗浓度较高，二抗上HRP 催化活力太强，同时你的显色底物处于一个临界点，反应时间不长，将周围底物催化完，形成了空白即“反亮现象”。将一抗和二抗浓度降低，或更换新底物。

答：如果能够排除下面的几个问题那么问题多半出现在一抗和抗原制备上。

a) 二抗的HRP 活性太强，将底物消耗光；

b) ECM底物中H2O2，不稳定，失活；

c) ECL底物没覆盖到相应位置；

d) 二抗失活。

是什么原因呢?

答：a) 可能是红灯造成的, 胶片本来就被曝光了，可以在完全黑暗的情况下操作.看是否有改善；

b) 显影时间过长。

答：DAB 有毒，但是比较灵敏，是HRP 最敏感的底物；ECM结果容易控制，但被催化时灵敏度差一点，但如果达到阀值，就特别灵敏，可以检测pg 级抗原。要看你实验的情况。

答：a)抗原形成了二聚体。增多巯基乙醇量，煮沸变性时间延长，可以打开二聚体；

b)蛋白本身的修饰如：糖基化，磷酸化等。

答：可能是：

a)样品浓度过低；

b)转移时间不够。

答：NaF是一种广谱磷酸化酶的抑制剂，一般最好加。但是不加也可以，大部分时候是不用加的。

13. 要验证某个细胞上有无该蛋白的存在，需要做免疫组化和western blot试验吗？做这两个试验时的一抗和二抗可以共用吗？

答：① 免疫组化可以用来进行定位，但是不能精确定量，而且有时会有假阳性，不易与背景区分；Western blot可以特异性检测某个蛋白质分子，进行定量，但是不能定位。

② 两种实验的一抗有时候不能通用，公司的产品说明一般都会说明可以进行什么实验，在免疫组化时，是否适合石蜡切片或者冰冻切片。

︶ 条带呈笑脸状

原因：凝胶不均匀冷却，中间冷却不好; 电泳系统温度偏高。

︵ 条带呈皱眉状

原因：可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或者两边聚合不完全。

拖尾

原因：样品溶解不好。

纹理（纵向条纹）

原因：样品中含有不溶性颗粒。

条带偏斜

原因：电极不平衡或者加样位置偏斜。

条带两边扩散

原因：加样量过多。

膜封闭不够

延长封闭的时间；选择更加适合的封闭液。

一抗稀释度不适宜

对抗体进行滴度测试，选择最适宜的抗体稀释度。

一抗孵育的温度偏高

建议4℃结合过夜。

选择的膜容易产生高背景

一般纤维素膜的背景会比PVDF膜低。

膜在实验过程中干过

实验过程中要注意保持膜的湿润。

检测时曝光时间过长

减少曝光时间。

目的蛋白有多个修饰位点（磷酸化位点、糖基化位点、乙酰化位点等），本身可以呈现多条带。

查阅文献或进行生物信息学分析，获得蛋白序列的修饰位点信息，通过去修饰确定蛋白实际大小。

目的蛋白有其它剪切本

查阅文献或生物信息学分析可能性。

样本处理过程中目的蛋白发生降解

加入蛋白酶抑制剂；样本处理时在冰上操作。

上样量过高，太敏感

适当减少上样量。

一抗特异性不高

重新选择或制备高特异性的抗体。

一抗不纯

纯化抗体

一抗或者二抗浓度偏高

降低抗体浓度。

可能的原因及建议

检测样本不表达目的蛋白

选择表达量高的细胞作为阳性对照，用于确定检测样本是否为阴性。

检测样本低表达目的蛋白

提高上样量，裂解液中注意加入蛋白酶抑制剂。

转移不完全或过转移

可以用丽春红染膜并结合染胶（考马斯亮蓝）后确定条带是否转至膜上或转移过头；适当调整转膜的时间和电流。

抗体不能识别测试种属的相关蛋白

购买抗体前应当认真阅读抗体说明书，确定其是否能够交叉识别测试种属的对应蛋白。

一抗孵育时间不足

建议4℃结合过夜。

二抗与一抗不匹配

选择针对一抗来源的种属的抗体。

洗膜过度

洗膜时间不宜过长，加入的去垢剂不宜过强或过多，建议使用0.1%的弱去垢剂Tween-20。

膜上多处出现黑点或黑斑

原因：抗体与封闭试剂发生非特异性的结合。

反白（条带显白色）

原因：目的蛋白含量太高或者一抗浓度偏高。

蛋白分子量偏低或偏高

原因：胶浓度不适合，高分子量要用低浓度胶；小分子蛋白要用高浓度胶。

操作有毒试剂时，带手套和口罩，且操作挥发性试剂应在通风橱中进行。

引起电泳涂料沉淀有哪些原因

1、同性或异性杂质离子的进入势必与电泳漆带电树脂发生反应而形成一些络合物或沉淀物，这些物质的形成就破坏了电泳漆原有的电泳特性和稳定性。对电泳涂装的前处理质量应严格把关。这不仅对提高产品涂装质量是必要的，而且对维护电泳漆液的稳定性也是极为重要的。纯水的水质和磷化液的选择也是何等的重要。

2、溶剂为了使电泳涂料有良好的分散性和水溶性，涂料原漆中往往含有一定比例的有机溶剂。在正常生产时，有机溶剂的消耗随着补漆工作的进行而得到了及时补充。但如果生产不正常或温度过高造成溶剂消耗（挥发）过快又得不到及时补充、至使其含量降低至下限以下时，工作漆液亦会发生变化，它使涂膜变薄，严重时，还会使漆液中树脂凝聚或沉淀。因此，在槽液管理过程中，应随时注意电泳漆液中溶剂含量的变化，必要时，进行溶剂含量分析，及时补加相应数量的溶剂。

3、槽液温度

电泳涂料对温度也有一个适应范围。温度的升高或降低会加快或减慢电沉积过程，使涂膜增厚或变薄。如电泳漆液温升得过高，溶剂挥发过快，容易造成漆液凝聚沉淀。为了使漆温始终处于一个相对的温度，需配备一台电泳冷热恒温机。

4、固体份漆液的固体份含量不仅影响产品涂装质量，而且也是影响漆液稳定性的一个因素。如漆液固体份过低，则其粘性降低，这就促使了漆液的沉淀。当然，过高的固体分也不足取，因为过高，涂件泳后夹带增多，流失增加，降低涂料利用率，使成本增加。

5、循环搅拌在生产过程中，管理人员必须随时注意电泳漆液的循环搅拌是否良好，一些仪表压力（如过滤器、超滤器）是否正常。保证漆液每小时循环4-6次，底部漆液流速是液面漆液流速的2倍左右，不要使电泳槽形成搅拌死角。非特殊情况，不要停止搅拌。

电泳与沉淀问题!

带电胶体电泳后不会产生沉淀

胶体是以分散质粒子大小为特征的，它只是物质的一种存在形式，如NaCl溶于水形成溶液，如果分散在酒精中则可形成胶体。

胶体种类很多，按照分散剂的不同，可分为液溶胶、气溶胶和固溶胶。分散剂是液体的，叫做液溶胶，如Fe(OH)3、AgI胶体；分散剂是气体的，叫做气溶胶，如雾、云、烟等；分散剂是固体的，叫做固溶胶，如烟水晶、有色玻璃等。

电泳现象：

胶粒在外加直流电场的作用下，胶体粒子在分散剂里向阴极或阳极作定向移动，此现象表明胶粒带电荷（胶体呈电中性）。

胶体的聚沉：

胶粒在一定条件下相互结合成大颗粒而沉淀的过程，方法有：

（1）加入电解质

（2）加热

（3）加入与胶粒带相反电荷的胶体

western blot电泳液和转膜液的配方在哪里可以购买

这个配方不用购买了，一般公司的目录上有的。象宝生物目录上比较全。或者在网上找一找。又不是什么专利配方。如果用量少，可以买现成的，如果用量大，当然是买来原料自己配了。

5×Tris-甘氨酸电泳缓冲夜 配制量：1升

所用试剂：Tris碱，甘氨酸和 SDS

配方： 15.1 Tris碱

94g 甘氨酸

50ml 10％ SDS

或5g SDS

用900ml水充分溶解后，pH值约为8.4，用少量浓盐酸（约2.5ml）调至pH8.3，定容至1升，室温贮存备用。

使用时，直接用双蒸水稀释五倍（100ml缓冲液+400ml双蒸水,混匀，常温保存）。一般此电泳液可反复使用三到五次，如果发现有明显沉淀或者漂浮时，请丢弃换新的。

10×电转液 (1L)

所需试剂 ： Tris，甘氨酸和SDS

配方： 30.3g Tris

144g 甘氨酸

3.7 g SDS (如有必要可加)。

用800ml蒸馏水溶解后定容至1L。分装室温储存。

参考资料：http://www.biohao.com/shownews.asp?id=347